Дизайн, синтез и биологическая активность производных нуклеозидов
Нуклеозиды представляют собой важную группу природных соединений, входящих в состав как биополимеров, так и низкомолекулярных соединений, регулирующих множество биохимических процессов, протекающих в клетке. К настоящему времени половина противовирусных и четверть противоопухолевых лекарств, применяемых в современной клинической практике, являются производными нуклеозидов. Поэтому данная группа соединений представляет собой перспективную основу для создания новых лекарственных средств.
Одним из научных направлений нашей лаборатории является разработка методов получения и химическая модификация нуклеозидов для создания новых прототипов лекарственных средств, а так же для решения фундаментальных задач биохимии и молекулярной биологии.
Результаты исследований
Впервые синтезирован большой ряд миметиков поли(ADP-рибозы) на основе дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов, в которых пирофосфатный остаток в природном полимере заменен на фосфатный. В этих соединениях сохранены основные важнейшие функциональные группы и расстояние между ними. Изучены биохимические свойства этих биополимеров.
Предложены новые подходы для снижения цитотоксичности ряда нуклеозидных производных природного происхождения и их синтетических аналогов, обладающих противовирусной активностью.
В ряду липофильных нуклеозидов обнаружены эффективные ингибиторы ДНК-тирозилфосфодиэстеразы I человека (TDP1), важного фермента репарации ДНК, с IC50 0.3 — 18.6 мкМ. Обнаружены соединения-лидеры, которые усиливают цитотоксический эффект топотеканана на карциному Льюиса мышей и при этом обладают низкой собственной токсичностью, что делает их перспективными соединениями для разработки на их основе новых лекарств, направленных на проведение сопровождающей терапии опухолей.
Оптимизирован метод получения моносахаридных и дисахаридных нуклеозидов и их липофильных производных.
Химико-ферментативный синтез производных природных нуклеозидов и гетероциклических оснований
Ферментативные методы образования N-гликозидной связи дополняют химические и в некоторых случаях имеют несомненные преимущества. В лаборатории проводятся исследования по использованию биокатализаторов из прокариот в синтезе биологически активных соединений и осуществляется подбор оптимальных условий проведения реакций. Исследования включают поиск и синтез новых доноров углеводного остатка, изучение субстратной специфичности и толерантности гликозилтрансфераз в отношении модификаций гетероциклических оснований. Химико-ферментативный подход к получению производных нуклеозидов и гетероциклических оснований базируется на выборе стратегии синтеза целевого соединения путем комбинирования и очередности химических и ферментативных стадий с учетом регио- и стереоселективности реакций.
Результаты исследований
Разработана математическая модель реакции ферментативного трансгликозилирования, катализируемой нуклеозидфосфорилазами, для прогнозирования выхода в реакции трангликозилирования.
С помощью ферментативного синтеза получен широкий ряд соединений производных рибозы и дезоксирибозы, содержащих модифицированные по различным положениям гетероциклические основания и обладающих биологической активностью в отношении ряда вирусов и отдельных линий опухолевых клеток.
На основании полученных данных определены оптимальные условия проведения ферментативного трансгликозилирования, катализируемого нуклеозидфосфорилазами: выбраны наиболее эффективные нуклеозидные доноры углеводного остатка и определен диапазон концентраций фосфат-аниона.
Дизайн, синтез и биологическая активность производных цитокининов
Цитокинины — группа фитогормонов, играющих важнейшую роль в процессе роста и развития растений, а так же в адаптации растений к внешним воздействиям. Одним из важнейших эффектов цитокининов является стимуляция пролиферации клеток. Кроме того, цитокинины способствуют формированию побегов, стимулируют прорастание семян и образование пигментов, активируют формирование хлоропластов и т.д. Цитокинины представляют собой N(6)-замещенные производные аденина.
Синтетические аналоги цитокининов и цитокининовых нуклеозидов обладают широким спектром биологической активности. В ряду этих соединений были найдены производные, проявляющие противоопухолевую и противовирусную активность, активность в отношении простейших одноклеточных организмов, вызывающих инфекционные заболевания и др.
Одним из направлений нашей лаборатории является поиск новых биологически активных аналогов природных цитокининов и цитокининовых нуклеозидов.
Результаты исследований
Проведены масштабные исследования биологической активности большой серии синтетических производных N(6)-бензиладенозина, являющегося природным цитокинином. Изучено взаимодействие с индивидуальными цитокининовыми рецепторами на ряде модельных растений. Выявлены соединения, не только проявляющие высокую фитогормональную активность, но и специфичные к определенным рецепторам. С учетом многообразия эффектов цитокининов на рост, развитие, устойчивость и продуктивность растений, полученные знания могут способствовать появлению новых подходов к управлению ростом и развитием ценных для человека видов растений.
Впервые обнаружено, что природные цитокининовые нуклеозиды N(6)-изопентениладенозин и N(6)-бензиладенозин обладают высокой противовирусной активностью в отношении энтеровируса человека EVA71. В результате оптимизации их структуры в ряду синтетических аналогов цитокининовых нуклеозидов обнаружены нетоксичные вещества с высокой противовирусной активностью (EC50 0.1 — 1 мкМ) и высоким индексом селективности (>1000).
Впервые показано, что ряд производных цитокининовых нуклеозидов, содержащих объемные гидрофобные заместители как в N(6)-положении аденина, так и в 5′-положении рибофуранозы демонстрируют высокую ингибиторную активность (ЕС50 1 — 10 мкМ) в отношении ряда флавивирусов, включая вирус клещевого энцефалита (ВКЭ), вирус желтой лихорадки (ВЖЛ), вирус лихорадки лихорадки Западного Нила (ВЗН).
Модификация ДНК-аптамеров
Олигонуклеотидные конструкции
Модифицированные G-квадруплексы
ДНК-аптамеры являются высокоспецифичными лигандами для различных молекулярных мишеней, в том числе белков. Аптамеры для конкретной молекулы-мишени получают из олигонуклеотидных библиотек методом направленной селекции (SELEX). Благодаря практически неограниченному выбору молекул-мишеней, аптамеры могут функционировать как терапевтические средства, диагностические зонды или даже средства доставки других агентов. Дизайн, синтез и исследования модифицированных аптамеров, в частности на основе G-квадруплексов, являются одним из ключевых направлений деятельности лаборатории.
Результаты исследований 2022-23 гг.
Разработан новый подход к усилению аффинных и ингибиторных характеристик тромбинового аптамера за счет создания дополнительного участка связывания с белком на основе коротких пептидов. Ингибиторная активность наиболее активного аптамер-пептидного конъюгата увеличивается в 6 раз по сравнению с немодифицированным прототипом.
Впервые получены и исследованы неприродные 3- и 4- полочные аналоги тромбинового аптамера с антипаралельной архитектурой G-квадруплекса. Модифицированные цепи квадруплексов содержат альфа-2′-дезоксигуанозин — нуклеозидный аналог с предпочтительной анти-конфигурацией гликозидной свзяи.
Результаты исследований 2024-25 гг.
В 2024-2025 гг. впервые были получены антипараллельные внутримолекулярные трехслойные G-квадруплексы (GQ) с идентичной конфигурацией G-тетрад. Неприродный альфа-аномерный аналог 2′-дезоксигуанозина использовался в качестве миметика syn-dG для контроля полярности G-тетрад. Идентичная полярность тетрад была подтверждена с помощью спектроскопии КД. Антипараллельные GQ-структуры продемонстрировали высокую термическую стабильность, пропорционально числу модифицированных цепей в их структуре.
С использованием альфа-2′-дезоксигуанозина получены синтетические двухмодульные олигонуклеотидные конструкции, способные к образованию антипараллельного GQ на выбранном участке ДНК. Показано, что связывание синтетической конструкции с одноцепочечной ДНК эффективно блокирует ее функцию как матрицы в реакции ферментативного синтеза ДНК при температурах до 50 °C.
В 2024-2025 гг. нами синтезирован амидофосфит тимидин-инозинового димера (TID) для синтеза модифированных олигонуклеотидов. TID позволяет осуществлять широкий спектр постсинтетических модификаций олигонуклеотидов с использованием клик-химии, включая конъюгацию с флуоресцентными метками и малыми молекулами, получение разветвлённых олигонуклеотидных конструкций и иммобилизацию. TID-модификация олигонуклеотидной цепи может быть полностью удалена для восстановления цепи ДНК в её нативном состоянии. Полное удаление временной функциональной группы проводят посредством окислительного отщепления инозинового фрагмента с образованием природного тимидина вместо модифицированого фрагмента.
Исследования структуры базальных промоторов РНК-полимеразы II
Традиционный биоинформатический анализ ДНК основан на предположении, что одномерная текстовая последовательность нуклеотидов является проекцией ее вторичной структуры. Это предположение не позволяет учесть те случаи, когда практически одинаковые структурные характеристики ДНК формируются существенно различающимися последовательностями. Мы дополнили традиционный текстовый анализ базальных промоторов РНК-полимеразы II анализом их локальной структуры. Такой подход к анализу геномной ДНК можно назвать «структурной биоинформатикой».
Результаты исследований 2022-23 гг.
Определены структурные особенности ДНК и ее динамики на участках базальных промоторов РНК-полимеразы II мРНК эукариот. Исследованы 186867 промоторов из 15 различных организмов. Показано, что структурная организация базальных промоторов у многоклеточных и одноклеточных эукариот одинакова. Это позволяет говорить об эволюционной устойчивости такой структуры. Ее особенностями является наличие двух сингулярных областей — гексануклеотида в позиции -2 — +4 (TSS) и октануклеотида ~ -28 н.п. (ТАТА-бокс), для которых определены варианты окта- и гексануклеотидов и их конформационные особенности.
Определены структурные особенности ДНК и ее динамики на участках базальных промоторов РНК-полимеразы II некодирующих РНК (антисенс-РНК и длинные межгенные РНК Н. sapiens и M. musculus). Показано, что структурная организация их базальных промоторов аналогичная таковой для мРНК, однако отличается практически полным отсутствием мотивов, которые отвечают за прямое узнавание белками аппарата РНК-полимеразы II. Эта особенность является следствием высокой энтропии текста на всех участках промоторов некодирующих РНК за исключением гексануклеотида на участке старта транскрипции (TSS), где сохраняется высокая избирательность к последовательности. Прямым следствием этих текстовых отличий является низкий уровень транскрипции некодирующих РНК и ее спонтанность.